两株苯酚降解菌联合PGPR对番茄根际土壤中苯酚降解和植物生长

第二章 苯酚降解菌的分离、鉴定及其降解能力的测定
我国每年有大量的原油及其加工品流入环境,能够改变土壤有机质的组成和结构,影响作物发育,同时通过生长于该土壤中的植物及其产品,能以食物链方式影响到人类的身体健康。
在石油污染物中,苯酚作为模式污染物受到相当的重视。根据美国环境监察局要求,自然水体,陆地和城市排水中允许存在的苯酚含量是0.5mg/L。同时苯酚是一种高挥发性的有机物,广泛存在于工业产品,同时也可以自然存在,如某些食物和人畜粪便中(尿液中含有0.5-80mg/L苯酚)。苯酚在日常生活中也非常常见,如杀菌消毒剂、漱口水、治疗咽喉、痔疮和某些神经疾病的药物中,而木材燃烧、汽车尾气和吸烟也都有苯酚产生,另外苯酚作为大量有机化合物生物转化的中间产物或终产物在环境治理方面也非常重要。
微生物高速度的繁殖特性和遗传变异性使它的酶体系能够以最快的速度适应外界环境的变化从而显示出其在环境治理上的高效性和多样性。 本章从上海市奉贤区大田作物根际土壤、苔藓土、园艺土和石油浸润土壤这四种土壤样品中进行了苯酚降解菌的分离筛选,运用16S rDNA序列分析与NCBI上已知序列进行比对,确定菌株的种类。为了在后续的实验中更好的运用,本研究随后对菌株在培养基中以及在土壤中的苯酚降解能力分别进行了测定,挑选了最优的菌株进行后续研究。
1 实验样品与材料
1.1 土壤样品
本章所用土壤样品为上海市奉贤区大田作物根际土壤、苔藓土、园艺土和石油浸润土壤。
1.2 仪器和设备
常规塑料器皿、接种环、玻璃器皿、移液枪、电子天平、超净工作台、分光光度计、台式摇床、精密pH计、振荡器、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、恒温水浴锅、PCR 仪、振荡器、水平DNA 电泳槽、电泳仪、紫外凝胶成像系统。
1.3 主要试剂
实验用水为新鲜的蒸馏两次的双蒸水,所用各试剂均为AR.级别的试剂。用于PCR扩增的试剂购于Takara生物工程有限公司。16S rDNA序列扩增引物由上海生工生物技术有限公司合成。16S rDNA序列的测定工作由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
1.3.1 4-氨基安替比林直接分光光度法测定所用试剂
1)无酚水
在每1000mL双蒸水中加入0.2g经200℃恒温活化30min的粉末状活性炭,震荡摇匀后静置过夜,用双层滤纸过滤后置于玻璃瓶中,使用时避开橡胶制品。
2)苯酚标准贮备液
将1.0g苯酚加入至灭菌过的无酚水中,定容至1000mL,溶液浓度为1mg/mL。将此溶液贮存于棕色瓶中,4℃冰箱避光保存,可稳定保存一个月。
3)苯酚标准中间液
按试验需求取适量苯酚标准贮备液,加入灭菌过的无酚水中稀释,使苯酚浓度达到0.01mg/mL,此溶液不可保存,当天使用当天配置。
4)缓冲溶液
称取20.0 NH4Cl溶于浓氨水中,并定容至100mL,置于冰箱密闭冷藏保存,pH约为10.0,浓氨水具有较强的挥发性,配置应快速完成,并尽量处在低温条件下,根据实际情况配置,最好当天使用当天配置,防止由于氨的挥发导致浓度和pH变化。
5)4-氨基安替比林溶液
称取2.0g 4-氨基安替比林溶于灭菌过的无酚水中,并定容至100mL。将此溶液贮存于棕色瓶中,4℃冰箱避光保存,可稳定保存一周,最好当天使用当天配置。
6)铁氰化钾溶液
称取8.0g 铁氰化钾溶于灭菌过的无酚水中,并定容至100mL。将此溶液贮存于棕色瓶中,4℃冰箱避光保存,可稳定保存一周,最好当天使用当天配置。
1.3.2 电泳试剂
1)50×TAE电泳缓冲液
称取冰醋酸557.1mL、Tris碱242.0g、EDTA(0.5M,pH8.0)100mL,用双蒸水定容至1000mL,使用时稀释50倍。
2)EB溶液
将此溶液(0.5mg/L)贮存于棕色瓶中,室温下避光保存,EB有剧毒,实验室操作时必须戴手套。
1.4 培养基
1.4.1 富集培养基
牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g,氯化钠5.0g,苯酚200mg,用双蒸水定容至1000mL,pH调节至7.0-7.2,苯酚在培养基灭菌后于超净台无菌环境加入。
1.4.2 无机盐筛选培养基(MSM)
KHXPO4 0.5g,K2HPO4 0.5g,MgSO4•7H2O 0.2g, CaCl2 0. 1g,NaCl 0.2g,NH4NO4 1.0 g,微量元素1mL,用双蒸水定容至1000mL,苯酚按试验需要量添加。
微量元素为FeSO4•7H2O O.2g,MnSO4 0.065g,ZnSO4•7H2O 0.04g,CoCl2 0.1g,用双蒸水定容至1000mL,在每1000mL的无机盐筛选培养基中加入1mL微量元素,苯酚均在培养基灭菌后于超净台无菌环境中加入。
1.4.3 无机盐固体培养基
在1.2.2描述的培养基中加入1.5%-2.0%的琼脂。
2 实验方法
2.1 苯酚降解菌株的富集筛选
取土壤样品(1g/份)加入50mL无菌双蒸水震荡摇匀,制成土壤悬液,按5%的接种量接入装有100mL苯酚浓度为200mg/L的富集培养基的三角瓶中,同时在装有培养基的三角瓶中加入数粒小玻璃球,30℃,200rpm摇床培养48h。按苯酚梯度压力进行驯化富集,每次以5%的接种量转移至苯酚浓度更高的新鲜富集培养基中,相同条件下培养48h。驯化共进行4次,直至苯酚浓度达到1000mg/L。
驯化结束后,用移液枪吸取100uL菌液涂布于固体筛选培养基上,30℃恒温培养5d。
2.2 苯酚降解菌株的分离纯化
从筛选平板培养基上挑选生长较快、长势较好,且形态与其他菌落有差别的单菌落,在富集平板培养基上进行多次划线分离,得到纯菌落。
将得到的纯菌落重新划线于固体筛选培养基(苯酚浓度500mg/L)上,以确定菌落具有苯酚降解能力。
2.3 菌株的保藏与活化
配置甘油溶液(双蒸水:甘油=4:1),充分混合后在121℃下灭菌20min,冷却保存备用。将待保藏的菌株置于富集培养基中摇床培养24h,将菌液4000rpm离心20min,去除上清液,收集下层菌体至1mLEP管中,在超净台中加入灭菌的甘油溶液,充分混匀后迅速冷冻,置于-80℃冰箱中保藏,可稳定保存2-3年。
活化时,将EP管中的菌种37℃恒温解冻,接至富集培养基,30℃条件下培养3天左右,按5%的接种量转移至新鲜富集培养基中摇床培养48h,得到目标单菌落。
2.4 菌株的分子鉴定
2.4.1 菌株基因组DNA的提取
将细菌接种至富集培养基中培养至生长对数期,用移液枪吸取1mL的菌液至EP管中,用浮板100℃水浴20min。充分灭活菌体后10000rpm离心2min。
下层沉淀为破碎的菌体,上清液溶质的主要成分为细菌基因组DNA。
2.4.2 菌株16S rDNA的PCR扩增
1)引物
正向引物:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
反向引物:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’
2)PCR 反应扩增体系
PCR 25μL体系:(单位:μL)
双蒸水 11
引物(正向、反向) 0.5×2
模板DNA 0.5
Taq mix(2U) 12.5
将以上成分置于1mLEppendorf管中,并充分混匀。引物提前稀释。
以上操作均须带一次性EP手套,并在超净工作台中进行。所用水均为灭菌的双蒸水,所用大、小Eppendorf管均用新的,并预先灭菌备用。
3)PCR 反应扩增程序
热启动后将装有PCR 体系的EP管置于PCR 仪中,94℃预变性5分钟后,开始循环,程序如下:
94℃ 30sec
50℃ 30sec
72℃ min
30个循环后,再72℃最终延伸10 分钟,4℃保存。
4)PCR 扩增产物的检测
取5μL的PCR 扩增产物,在1.0%琼脂糖凝胶(100V)上电泳,检测扩增产物的浓度和分子量。具体操作如下:
制胶:称取0.4g琼脂糖粉末,置于三角瓶中,加入25mLTAE缓冲液,加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中,待溶液温度降至65℃时,加入20μL EB溶液充分混匀后立即倒入制胶槽中,插入样品梳。在室温放置20min左右,至凝胶全部凝固后,轻轻拔出样品梳。将凝胶置于电泳槽中,使缓冲液完全没过凝胶。
加样:取5μ左右的样小心地加到样品槽中。同时另取已知分子量的DNA marker,在同一凝胶板上进行电泳。
电泳:维持恒压100V,电泳30min。
观察:将凝胶板置于琼脂糖凝胶成像系统下观察条带。
PCR 产物的纯化和测序由上海美吉生物技术有限公司完成。所得到的16S rDNA基因序列上传至Genbank,通过BLAST程序进行基因比对,最终确定菌株的种类。
2.5 菌株在培养基中的苯酚降解能力测定
将筛选得到的苯酚降解菌株接种于含有500mg/L苯酚的50mL无机盐筛选培养基中,摇床培养,每12h测定一次细菌浓度和苯酚浓度。
2.5.1 细菌浓度的测定
液体培养基中的细菌浓度用分光光度法进行测定,用OD600表示,即菌液在600nm处的吸光度值。
2.5.2 苯酚浓度的测定
初始菌液中的苯酚浓度为500mg/L,每12h测定一次苯酚浓度时用4-氨基安替比林直接光度法进行测定,以不接菌的无机盐培养基作为对照组。
1)苯酚标准曲线
取灭菌的三角瓶,加入0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、12.5mL的苯酚中间液,用容量瓶加双蒸水定容至50mL。加入0.5mL的缓冲溶液,充分混匀,加入1.0mL4-氨基安替比林溶液,充分混匀。再加入1.0mL铁氰化钾溶液,充分混匀后静置10min,然后将溶液置于510nm波长下以无酚水作为对照进行比色分析。所使用的比色皿均为玻璃比色皿,事先经过校正,光程为20mm。
经过空白校正后,使用测得数据绘制吸光度值对苯酚含量的标准曲线。
2)苯酚降解菌在培养基中对苯酚降解率的测定
将待测的苯酚降解菌株按吸光度调整到OD600为1的菌液,按1%的接种量接种至50mL无机盐筛选培养基(苯酚浓度为500mg/L),,30℃200rpm摇床培养。每隔12h取适量菌液,稀释100倍,离心取上清液,然后按4-氨基安替比林法测定上清液的苯酚浓度,最后根据苯酚标准曲线算出菌液中残余的苯酚浓度。
2.6 菌株在土壤中的苯酚降解能力测定
1)土壤中苯酚标准曲线
园艺土过4mm筛搅拌均匀,加入苯酚中间液使土壤中苯酚浓度分别为0、5、10、30、50、70、100、125、150、200、250mg/mL,充分搅拌土壤。
然后从上述不同苯酚浓度的每份土壤中取1g样品,加入50mL无菌的无酚水中混匀,9000rpm离心20min,取上清液,加入0.5mL的缓冲溶液,充分混匀,加入1.0mL4-氨基安替比林溶液。再加入1.0mL铁氰化钾溶液,充分混匀后静置10min,然后将溶液置于510nm波长下以无酚水作为对照进行比色分析。所使用的比色皿均为玻璃比色皿,事先经过校正,光程为20mm。
经过空白校正后,使用测得数据绘制吸光度值对土壤中苯酚含量的标准曲线。
2)苯酚降解菌在含酚土壤中对苯酚降解率的测定
实验所用土壤为园艺土,过4mm筛搅拌均匀,121℃灭菌3次备用。土壤与苯酚溶液(提前按比例配置的标准酚溶液)搅拌均匀,使土壤酚浓度达到500mg/kg。
将50g含酚土壤加入50mL的平底烧杯中,加入25mL菌液(细菌浓度为109cfu/mL),充分搅拌。在烧杯顶上盖上培养皿盖子,以减缓苯酚和水分的挥发。
对照组加入25mL无菌水。所有处理组均室温静置发酵,每隔12小时测定其苯酚含量。
取样方法为:取1g土样,加入50mL灭过菌的无酚水,充分混匀,9000rpm离心20min,取上清液按4-氨基安替比林法测定吸光度,对照土壤中苯酚测定的标准曲线,计算出土壤中苯酚含量。
实验周期为10天。
4 小结与讨论
根据本章结果可知,苯酚作为对植物有毒害作用的土壤污染物,在被降解的过程中,土壤的毒性也随之降低。苯酚降解菌株(PD14、PD15)降解了苯酚,保护了番茄幼苗以及JD37免受毒害的同时,JD37起到了促进植物生长的作用,因此联合接种组里番茄生长几乎没有受到苯酚的影响。
在含酚土壤中,单独接种PD15时,苯酚的降解率最高,能达到93%,单独接种PD14降解率为74%,联合JD37接种时降解率略微降低。然而PD14、PD15与JD37联合接种可以降低土壤毒性,促进含酚土壤中植物的生长。 单独接种PD菌株的处理组中,虽然土壤毒性降低了,但没有植物促生菌的存在,植物生长状况相对较差。实验结果表明联合接种PD15和JD37时的降解效率略低于单独接种PD15。这有可能是因为联合接种的条件下,土壤中PD15的浓度相对单独接种要低,导致降解较为缓慢。但同时PD14菌株的降解效率并未有显著下降,有可能是由于JD37促进了植物生长,而番茄幼苗的根系发育提高了土壤的通氧量,根系化合物的分泌为细菌生长提供了更丰富的养分。
在根际细菌与植物相互关系方面有很多相关报道,表明植物次生代谢物的数量和种类在不同的植物种之间差别很大,而不同植物与不同微生物之间的相互关系就更为复杂多样。
因此,苯酚降解菌株与植物促生菌在污染场地或农田植物根际联合接种可能成为一种行之有效的土壤修复手段,有待进一步的大田实验验证,本研究得到的结果也还有待更进一步的分析和证明。

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