浅析VIGS的作用机制

VIGS技术除在烟草（Gossele，等，2002）、番茄（张策等，2007）、豌豆（宋伟杰等，2007）和大豆（吕山花等，2010）等双子叶植物中应用成功外，许多单子叶植物病毒也被改建成载体，以便在单子叶植物中抑制基因表达(Oikawa，2007)。经过几年的发展，已有多种病毒载体在VIGS上成功应用，如烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus，TMV)、马铃薯X病毒、番茄金色花叶病毒(tomatogoldenmosaicvirus，TGMV)、烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus，TRV)、卫星病毒诱导的沉默系统(satellitevirus-inducedsilencingsystem，SVISS)、甘蓝缩叶病毒(cabbageleafcurlvirus，CbLCV)、玉米条纹病毒(maizestreakvirus，MSV)等(Burch-Smith等2004；王宏芝等，2005；Palmer等，1999)。大麦条纹花叶病毒(Lacomme等，2003)以及小麦矮缩病毒(wheatdwarfvirus，WDV)等(Matzeit等，1991)都已经用于基因沉默。BSMV，由于其广泛的寄主范围（McKinneyandGreeley，1965）使其成为单子叶寄主良好的RNA沉默载体（Holzberg等，2002）。这些载体的开发和利用为水稻和小麦等重要单子叶作物功能基因组研究提供了有效的工具。最近，感染单子叶植物的雀麦花叶病毒株Tall-fescue已经被改造用于VIGS，在重要的谷稻类作物中应用成功（Ding等，2006)。
在改良植物品质方面基因沉默技术被认为具有极大的应用价值(Tang，2004)。李加瑞等应用RNA干扰技术以Wx基因为靶基因极大地降低了小麦中直链淀粉的含量，而HarvinderS.等应用VIGS技术以GBSS基因为靶基因也同样降低了小麦中直链淀粉的含量（HarvinderS.等2011）。Kusabs及同事更是采用RNAi技术生产出能降低麦谷蛋白表达水平的稻米种类LGC-1(lowgluteincontent)，给不能消化麦谷蛋白的肾脏病人带来福音。郭志鸿等（2008）采用RT-PCR技术分别克隆了马铃薯SBE1基因的片段SⅠ和SBE2基因片段SⅡ，并将SⅠ和SⅡ顺序连接得到融合片段SⅢ，构建了以SBE1基因和SBE2基因为靶标的RNA干扰载体pRNAiⅢ，通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了表观直链淀粉含量介于59.31%～87.14%的转基因试管薯。
根据VIGS的作用机制，理论上引起目的基因沉默的最小插入片段为23个核苷酸(Bartel，2004)，但在实际操作中23个核苷酸长度常常不能有效地启动目标基因沉默的发生，所以需要选择数倍于23nt的目标基因片段(Ekengren等2003；Ratcliff等1997)。但也不能过长(Thomas等，2001；JackieCampbell等，2010)。为了使目标基因能够有效的沉默，有人对此研究的结果表明以200~500bp插入片段的沉默效果最佳(Burch-Smith等，2004；Ekengren等，2003；Lu等2003b)。当然，也可能存在其它影响沉默效果的因素，如目标基因序列的核苷酸组成(Thomas等2001)、siRNA及目标序列的碱基对的热力学特性等(Khvorova等2003；Schwarz等，2003)。
如何有效地使病毒载体转入植物细胞，是病毒在植物体内复制与转移，以及发生目标基因沉默的关键。目前通常把含目标基因的病毒载体转入农杆菌中，然后通过农杆菌介导法感染宿主植物。然而，农杆菌介导法在单子叶植物中尚未成功（姚丹青等，2009）。除此之外已发展了几种病毒嫁接方式，如牙签接种(Lu等2003a)、注射渗透(Fu等2005)、高压喷射(Liu等2002a)及真空渗透(Ekengren等2003)等。如果要在植物的局部区域获得有效的沉默，注射渗透技术比较理想(Fu等2005)。
病毒的传播和植物的生长情况都会影响基因沉默的成功率，而环境有影响着病毒的传播和植物的生长情况(Burch-Smith等2004)，其中温度对它们的影响最大。不同的VIGS载体在不同的植物中，引起高效基因沉默的温度也不同。例如，用TRV感染番茄，较好的沉默表型在22℃或更低的温度下发生；而用TRV感染烟草，合适的温度则在25℃左右(Burch-Smith等，2004；Ekengren等，2003；Liu等，2002a；Nethra等，2006)；25℃～29℃是BSMV在大麦上诱导基因沉默的适宜温度。另外，Fu等(2006)发现，低温和低湿的条件可以增强基因沉默的强度和延长沉默的持续时间。据张立荣（2011）等研究小麦VIGSPDS基因沉默效果较适温度在25℃~30℃。Harvinder等（2011）研究显示，在小麦上实施基于BSMV的VIGS实验，最佳的温度条件是白天22℃/夜间18℃。温度的控制可以使用生长箱来完成。
VIGS在鉴定功能基因组方面具有诸多优越性。VIGS能够直接在当代植株沉默目的基因，不存在传统方法中的诸多困难，目的基因缺失的表型在当代就能够鉴定出来，这体现了VIGS快速高通量的优点，具有重要意义。另外，VIGS技术还能够实现比对不同品种间的基因沉默，研究基因功能。尽管VIGS具有诸多优越性，但VIGS也存在一些限制。如VIGS有时可能难以完全抑制产生目标基因表达，残量低水平的mRNA仍然有可能支撑靶基因的功能，难以观察到表型变异，其功能也难以确定；经常引起整个侵染植株上靶基因的不一致沉默，在植株间、实验间沉默水平也可能不同；对于单子叶植物农杆菌介导法尚未成功等（姚丹青等，2009）。有些问题随着研究的深入是可以得到解决的，如可利用基因组序列和大量EST数据辅助设计VIGS载体的插入序列。VIGS效果是基于序列同源性，同源性越高，基因沉默效果越好；可通过建立VIGS载体的内部阳性对照，用可见表型标记出沉默的区域等方法来解决。另外，侵染的部位、次数等也可能会影响基因的沉默效果，这方面的研究有待进一步深入。
迄今，病毒载体的转染技术还没有形成一套非常成熟有效的方法，已有的报道也只是在少数物种中获得成功，如烟草、番茄、拟南芥等，许多接种条件还需要进一步优化，如感染缓冲液的选择、感染液浓度的确定以及接种方式的优化等。所以，在实际应用中，尤其对于尚无VIGS研究报道的植物，进行前期VIGS体系优化试验对利用该技术手段研究基因在植物中的功能显得更为重要。
大麦条斑花叶病毒有3条RNA链：α、β、γ，为短棒状病毒。小麦染病的症状为深绿和浅绿相间的不规则条纹，而早期会出现新叶基部发黄白的条纹，同时伴随株高降低，雌蕊育性降低，种子不饱满等。摩擦发可以使小麦感染BSMV，但在自然界中BSMV主要以侵染种子及花粉传播的方式传播。BSMV病毒可以在单倍体细胞中存活和繁殖。该载体的表达能力是Ti质粒载体的数倍。因其可以寄生Ti质粒不能侵染的单子叶经济作物如大麦、小麦、玉米、水稻等而被研究者选中开发为工程载体。此外BSMV载体拥有较大的基因组，可以容纳较大的外源基因，这也是研究者们所喜爱的一个优点。
目前为止，BSMV-VIGS技术在小麦中的应用已经有十年多的时间，BSMV载体主要应用在小麦、大麦、燕麦、野生二粒小麦、簇毛麦、二穗短柄草等禾本科植物。目前研究者们主要是改造BSMV的β，γ分子，其中以改造γ分子的报道居多。Holzberg等改造γb分子，首次实现BSMV-VIGS在大麦上应用，Cheng等修饰了BSMV的γb分子，使其具有了高通量克隆的特性。另外改造BSMV的β分子的VIGS系统也成功应用（Kawalek等）。此外，Campbell等同时利β、γ分子插入不同的基因，在大麦上同时实现了两个基因的沉默。
BSMV-VIGS研究的基因涉及了包括植物生长发育、抗病虫、抗干旱、品质改良等过程。另外,最近Bennypaul等等还通过构建PDS基因的BSMV重组载体研究VIGS的遗传性。Kawalek等利用BSMV-VIGS技术研究了与小麦衰老有关的PLD基因的功能。Bennypaul等利用该技术实现了小麦根中COI1基因的沉默。
BSMV-VIGS技术在小麦上研究与抗病虫相关的基因功能方面是一个很有效的工具，研究所涉及的基因包括与抗条锈病有关的TaHLRG、PTaRtL和TaSBL基因（刘迪；TaSTK基因张宁宁；抗叶锈病有关的基因Lr21、RAR1、SGT1和HSP90Scofield等、TaRAR1基因张立荣；抗白粉病有关的基因Mlo基因Várallyay等、抗大麦黄矮病有关的TNBL1基因赵丹等及与抗蚜虫有关的基因WRKY53Van等等。其中Várallyay等的研究中，同时沉默了PDS基因和Mlo基因，Van等的研究是首次利用VIGS技术研究小麦抗虫基因的报道。
VIGS技术也可以研究与抗逆相关的基因，如抗干旱胁迫相关的基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因SAMS、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因SAMDC和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因γ-ECS李昌澎[37]。在品质改良方面，Ma等[38]利用VIGS技术研究了与蛋白质及淀粉合成有关的基因HMW-GS1Bx14的功能。这也是首次利用BSMV-VIGS技术研究小麦穗子和籽粒中的基因功能的报道，对后来研究类似基因的研究者来说很有借鉴意义。Bennypaul等[8]也通过构建插入GBSS基因片段的BSMV-VIGS载体，实现了小麦籽粒中GBSS基因的沉默，降低了籽粒淀粉中质量淀粉的含量。