1.本文构建了体外培养的角膜上皮细胞系,并在国内首次探讨Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus-1,HSV-1)对体外培养角膜上皮细胞系的基质金属蛋白酶2(matrix metallo proteinases-2,MMP-2)的表达情况。本研究成功将HSV-1转染至体外培养的HCE细胞中,并检测了感染初期MMP-2 mRNA和蛋白表达,验证了感染头2天角膜上皮细胞内MMP-2蛋白表达的变化,说明上皮细胞在感染早期合成的MMP-2在角膜基质溃疡的形成中起重要作用。
2.本文探索了FAK信号通路与HSK的发病机制的关系,此研究在国际上暂未见相关报道。本文观察了HSV-1感染角膜上皮细胞2h, 20h, 40h 后MMP-2, 粘着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)及磷酸化粘着斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase, phosphor-FAK)的表达情况及其表达变化的相互关系。研究认为FAK大量表达参与激活MMP-2等细胞因子的表达,磷酸化的FAK在病毒入侵细胞和MMP-2的激活过程中起着重要作用,促进了角膜基质溃疡的形成。
中文摘要
第一部分 单纯疱疹性角膜炎中基质金属蛋白酶mRNA的表达
目的 研究Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)所致的角膜炎中基质金属蛋白酶(MMP-2,MMP-9)mRNA的表达,探讨MMP-2,MMP-9mRNA的表达与角膜基质炎病程变化的关系。
方法 雌性BALB/c小鼠20只随机分为4组,每组5只,每只均取右眼为实验眼。搔刮角膜上皮后点滴1型单纯疱疹病毒(HSV-1)诱发单纯疱疹性角膜炎(HSK)。裂隙灯下每日观察小鼠角膜变化并分别于感染后第0,2,7,14天处死小鼠,收集感染角膜。抽提角膜组织中总RNA,将RNA逆转录为cDNA后进行PCR扩增,扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳,采用计算机凝胶成像系统提取图像并分析电泳条带灰度值。采用方差分析SNK-q检验对实验数据进行半定量分析。
结果 感染后小鼠均可见典型的单纯疱疹性角膜炎表现,感染后第2天见树枝状上皮缺损,继而发生浅层基质炎症,炎性细胞浸润,第7天后角膜基质水肿,基质浸润,溃疡形成及新生血管形成,至第14天逐步加重。除感染后第0天组5例标本MMP-9 mRNA均为阴性表达外其余各组均获得阳性目的片段。MMP-2,MMP-9mRNA的表达大体上随感染天数增加呈增高的趋势。其中MMP-2mRNA的表达在感染后第0天与第2天差异没有显著性(P>0.05),感染后第7,14天mRNA的表达逐渐增高差异有显著性意义(P<0.01)。MMP-9mRNA的表达在感染后第0天,第2天,第7天逐渐增高,第14天表达达到最高值,但其中第7天较第2天的增高差异没有显著性(P>0.05),其余各组差异均有显著性意义(P<0.01)。 结论 在实验性单纯疱疹病毒性角膜基质炎中存在基质金属蛋白酶(MMP-2,MMP-9)mRNA的表达,且其表达随着角膜炎性反应的加剧,溃疡范围的扩大及新生血管的增加而逐渐增高。推测MMP-2,MMP-9mRNA的高表达参与了角膜溃疡,新生血管形成等病变的发生。 [关键词] 单纯疱疹病毒 角膜基质炎 基质金属蛋白酶 RT-PCR第二部分 实验性小鼠单纯疱疹角膜炎中粘着斑激酶的表达目的:探讨Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus-1,HSV-1)感染BalB/c小鼠眼角膜所致的粘着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)表达的变化。方法:以HSV-1感染BalB/c小鼠眼角膜制作单疱病毒性角膜炎(HSK)模型,应用免疫组织化学法检测的FAK表达。结果:HSK模型的角膜上皮细胞排列紊乱,基质水肿,中性粒细胞增多,FAK阳性细胞数增多,同阴性对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)结论:在实验性小鼠HSK动物模型中检测到了FAK在角膜上皮细胞中大量表达,其表达趋势随感染时间的延长呈阶梯向上的波形。[关键词] 单纯疱疹病毒 角膜基质炎 粘着斑激酶 第三部分 HSV-1感染对人角膜上皮细胞MMP-2和FAK表达的研究目的:探讨Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus-1,HSV-1)感染对体外培养人角膜上皮细胞MMP-2和FAK表达的影响。方法:以HSV-1(F株)感染体外培养人角膜上皮细胞(human corneal epithelial cell,HCE),应用聚合酶链反应法、免疫印迹法、免疫组织化学法、免疫荧光法分别于2h、20h、40h检测HCE基质金属蛋白酶2(matrix metallo proteinases-2,MMP-2)和粘着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)表达情况。结果:感染后2h 、20h、40h,MMP-2和FAK mRNA表达分别同非感染细胞相比显著增强(P<0.01,P<0.05);感染后2h MMP-2、FAK、P-FAK蛋白表达同非感染细胞相比无显著差别(p>0.05);感染后20h、40h, MMP-2、FAK、P-FAK蛋白表达同非感染细胞相比差别显著(p<0.05)。结论:在HSV-1感染的早期,磷酸化的FAK在病毒入侵细胞和MMP-2的激活过程中起着重要作用。FAK激活MMP-2的具体通路有待进一步研究。【关键词】 基质金属蛋白酶;粘着斑激酶;单纯疱疹病毒;角膜炎AbstractPart One: Expression of Matrix Metalloproteinase mRNA in Experimental Herpes Simplex Virus KeratitisObjective To explore the expression of matrix metalloproteinase (MMPs) mRNA in corneas with infection of herpes simplex virus type-1 (HSV-1) and to investigate the relationship between the expression of MMP-2, MMP-9 mRNA with the course of keratitis .Methods Twenty female BALB/c mice were averagely divided into 4 groups stochastically. Take the right eyes as the experiment eye, and dropping HSV-1 on the corneas after scratched epidermis of the corneas. Keratitis was induced in BALB/c mice by inoculating the cornea with HSV-1 (KOS strain). Observed changes of the corneas through the slit lamp everyday. Corneas were harvested at days0, 2, 7 and 14. Extracted the total RNA from the tissue of cornea, then reverse transcripted the RNA into cDNA . Amplified the cDNA and the products were electrophoresis in the agarose gelatum. The expression of MMP-2,MMP-9 mRNA were examined by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). To analyzed the data half-quantu using analysis of variance SNK-q test.Results The typical manifestation of HSK were seen on each mice after infection 2 days. The epidermis of the corneas were Coloboma, then the inflammation in the superficial layer stroma occurred with the inflammation cells infiltrating. At the 7 days post-infection the corneal stroma were edema, the ulcer and blood vessel formate. The situation become more Severe at 14 days post-infection. Each groups showed positive segments except the expression of MMP-9 mRNA in the normal group. The MMP-2 mRNA at day 2 post-infection did not express significant enhance than the normal group(P>0.05).The MMP-9 mRNA at day 7 post-infection did not express significant enhance than the 2 day post-infection group(P>0.05).The differences among other groups were statistically significant (P<0.01) and they presented the trend that the expression increased with the day increased post-infection on the whole. Conclusions The expression of the MMP-2 MMP-9 mRNA can be detected in HSK cornea. The expression was increase with the inflammation reaction intensify. This enzyme was shown to contribute to the ulcerative and neovascularization process that occurs in the corneal in response to HSV infection. [Key Words] herpes simplex virus;keratitis ;Matrix Metalloproteinase; RT-PCRPart Two:Expression of Focal adhesion kinase in Experimental Herpes Simplex Virus KeratitisObjective: To investigate the expression of the focal adhesion kinase (FAK) in herpes stromal keratitis (HSK). Methods: The cornea of 24 BalB/c mice was infected with HSV-1 to construct a model of HSK. Six additional mice served as negative controls. Immunohistochemical staining was used to detect FAK expression. Results: In the HSK model, the corneal epithelial cells were deranged and the number of neutrophils and FAK-positive cells were increased; all were significantly different from negative controls (P<0.05). Conclusions The expression of the FAK can be detected in HSK cornea. The expression was increase with the inflammation reaction intensify. [Key Words] herpes simplex virus;keratitis ;FAKPart Three: Relationship of matrix metalloproteinase expression and activation of the FAK signaling pathway in HSV-1 infected human corneal epithelial cellsObjective: To investigate the relationship between matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and activation of the focal adhesion kinase (FAK) signaling pathway in herpes stromal keratitis (HSK). Methods: Human corneal epithelial (HCE) cells cultured in vitro were infected with HSV-1, and expression of MMP-2, FAK and phosphorylated FAK (P-FAK) in HCE cells were detected using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), Western blotting assays, and immunohistochemistry at 2, 20 and 40 h. Results: Repeated measures analysis of variance of RT-PCR showed no significant difference in MMP-2 and FAK mRNA expression in infected cells at different times, and no significant differences between infected cells and the negative control group. There was no interaction between groups and time points. Pairwise comparisons showed that MMP-2 and FAK mRNA expression were significantly increased in virus-infected cells compared to controls. Over time, MMP-2 and FAK mRNA expression did not differ significantly in virus-infected cells or in control cells. Western blotting assays showed no significant difference in P-FAK, FAK or MMP-2 expression between infected cells and control cells at 2 h (P>0.05). Infected cells differed significantly from the control cells at 20 and 40 h (P<0.05). P-FAK, FAK and MMP-2 expression in virus-infected cells at 2 h differed significantly from those at 20 and 40 h (P<0.05). Immunohistochemical staining results showed that longer infection time was associated with an increased number of cells staining positive for MMP-2, FAK and P-FAK. Conclusion: After HSV-1 infection of the corneal epithelium, the FAK signaling pathway is activated, leading to increased secretion of MMP-2 in the corneal tissue and accelerated formation of corneal ulcers and necrotic lesions.Key words: herpes stromal keratitis; matrix metalloproteinase; focal adhesion kinase pathway引 言I型单纯疱疹病毒(HSV-1)感染眼部引起的单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)是一种高复发率,高致盲率且严重影响视功能的目前国内外最常见的致盲性眼病。在HSK中组织损伤及失明多由炎性组织的免疫应答导致而不是直接由病毒毒性所致。病毒在角膜实质层内复制并引起Ag-Ab免疫反应导致角膜溃疡,新生血管形成及角膜瘢痕等严重病理改变。基质金属蛋白酶(MMPs)是降解细胞外基质(ECM)及基底膜成分的一族蛋白裂解酶,至今已发现了至少26种。ECM主要包括胶原,蛋白多糖,糖蛋白,糖胺多糖和弹力纤维五大类。其中胶原是ECM中最丰富的结构成分。MMPs几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质成分。所有MMPs均有以下理化特征:1 均以潜酶形式分泌,其前肽内含有一个半胱氨酸开关和两个高度保守区。一个高度保守区位于催化中心(含锌结合位点),另一个高度保守区位于N末端;2 均含有2个锌离子,其中一个位于催化中心为酶活性所必需的辅助因子;3 均含有2个钙离子,参与酶活性的激活并为酶活性的稳定所必需;4 均为内肽酶,能从肽链中间裂解底物;5 其酶活性能为相应的特异性抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinase,TIMPs)所抑制,此外MMPs还受到基因表达,酶原激活等多种不同水平上的调节。在体内MMPs参与了多种生理和病理过程,如形态发生,血管形成,结缔组织重建,损伤修复和肿瘤转移等。MMPs在多种生理及病理反应中发挥作用,如在角膜伤口愈合过程中可见角膜上皮细胞,基质细胞及中性粒细胞分泌多种MMPs以促进基底膜重塑,创面收缩,坏死组织清除及纤维修复组织沉积。当MMPs过度表达则可导致溃疡形成。又如在新生血管形成时可在血管内皮细胞及基质纤维母细胞中检测MMP-2,MMP-9的表达MMPs可通过直接降解基质或释放matrix -bound因子及生长因子达到促血管生成作用。同样HSV感染角膜后炎性细胞及角膜组织本身可产生MMPs并在角膜组织一些病理变化中发挥重要作用。前人的研究表明【1】,Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)感染角膜后由角膜细胞及角膜上皮细胞产生的MMP-2对单纯疱疹性角膜炎(HSK)的发展起着重要作用,主要是致角膜溃疡形成。然而,上述研究结果仅证实了HSK模型中MMP-2的表达和活性改变,尚不明确HSK究竟是通过何种机制导致MMP-2表达、分泌和活性改变的。根据国内国外相关研究成果,我们推测可能的机制是:(1)病毒感染直接激活角膜上皮细胞和中性粒细胞的细胞内信号传导通路、上调MMPs表达水平并刺激上述细胞分泌MMPs;(2)浸润的炎性细胞所释放的炎性因子激活角膜上皮细胞和中性粒细胞的细胞内信号传导通路、上调MMPs表达水平并刺激上述细胞分泌MMPs。然而上述对MMPs表达水平影响的推测机制究竟是HSV-1的直接作用于角膜上皮细胞,还是HSV-1引起炎性细胞释放的细胞因子的作用,抑或是两者同时作用,但影响程度不同。同时诱导MMPs分泌增加的机制究竟如何运行,这都需要深入探讨。有研究显示MMPs的分泌可通过激活多个细胞内信号传导通路来调控,其中包括粘着斑激酶通路[2]。粘着斑激酶(FAK)是一种重要的非受体蛋白酪氨酸激酶。它在细胞间及细胞与细胞外基质的粘附中起重要作用,同时与胚胎发育、周期调控、血管生成密切相关。FAK主要蛋白质结构由3个功能区域组成,即N端区、激酶区和C端区。其中激酶区为390~650位氨基酸残基区域,其氨基酸序列高度保守用以使相应蛋白质的酪氨酸残基磷酸化。在FAK中至少有6个酪氨酸磷酸化位点,其中Tyr397是最主要的自主磷酸化部位,在FAK分子间相互磷酸化和激活下游效应器的最大化中起到决定作用。未激活的FAK分子内N端区和C端区结构域相互连接,掩蔽了催化结构域和Tyr397位点。当FAK活化后构象发生变化,暴露催化结构域,同时Tyr397自身磷酸化,形成磷酸化粘着斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase, phosphor-FAK)。应用western bloting 检测结果显示FAK Tyr397磷酸化蛋白表达显著增加。当FAK活化后构象发生变化,暴露催化结构域,同时自身磷酸化,形成磷酸化粘着斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase, phosphor-FAK)。FAK活化后通过整合素等多条通路广泛参与多种细胞生物学过程[3]。研究发现[4-7],FAK蛋白被激活以后,可导致FAK-Src-p130Cas-Dock180信号复合物的形成并升高JNK( c-Jun NH2-terminal kinase)的激活水平从而刺激基质金属蛋白酶表达和活性的增加。因此我们认为,HSV-1感染角膜上皮后可能通过病毒本身或者炎性细胞释放细胞因子激活FAK导致角膜组织中MMPs的分泌增加来促进角膜溃疡及坏死性病变的形成。本研究采用免疫组化及分子生物学技术在HSK小鼠模型及体外培养的人角膜细胞系中探讨HSV-1直接诱导MMP-2分泌与FAK、P-FAK的关系以期能进一步认识HSK角膜溃疡形成的机制。第一部分 单纯疱疹性角膜炎中基质金属蛋白酶mRNA的表达材料和方法一. 动物模型建立6至8周龄雌性BALB/c小鼠20只,由武汉预防科学院动物实验中心提供,实验前双眼前节检查正常。小鼠随机分为4组,每组5只。第一,二,三,四组分别为感染后第0,2,7,14天组。采用乙醚吸入法麻醉小鼠,每只鼠均取右眼为实验眼。显微镜下十字交叉搔刮右眼角膜上皮后点滴Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus Ⅰ)5μl(105 plaque-forming units PFU)于角膜上(病毒由武汉大学医学院病毒所提供),按摩眼球并滞留20秒。感染眼每日用氯霉素滴眼液滴眼并在裂隙灯下观察角膜病变。角膜感染后第0,2,7,14天分别处死各组小鼠,取出角膜保存于-80℃度冰箱中。二.临床评价 角膜上皮及基质损害的严重程度以0-4+记分。上皮病变几分依据上皮表面病变面积的大小。0:无上皮病变;1+:上皮病变面积少于25%;2+:上皮病变面积少于50%;3+:上皮病变面积少于75%;4+:上皮病变面积为75%-100%[17]。三.组织病理学检测 角膜感染后4组角膜(20只)固定于Mc-Dowells液,即:4%福尔马林,1%戊二醛,0.13%蔗糖,0.07mol/l氢氧化钠,0.08mol/l磷酸钠(PH值7.2)6小时,随后系列酒精脱水,石蜡包埋,5μm厚组织切片并固定于经APES处理过的载玻片上,常规苏木精-伊红染色。角膜感染后第0,2,7,14天,观察角膜上皮缺损,基质溃疡形成,基质水肿,炎性细胞浸润及新生血管形成。四. 试剂及引物合成TRIZOL一步法抽提总RNA,试剂盒购自Iavitrogen公司,MMLV逆转录酶购自美国promega公司,Rnasesin.dNTPmix由TaKaRa大连宝生物提供,TaqDNA聚合酶由Biostar公司提供,oligodT18及引物由上海生工合成。MMP-2引物设计参照文献[2], 上游为 5,-GAGTTGGCAGTGCAATACCT-3,,下游为5,-GCCGTCCTTCTCAAAGTTGT-3,,扩增片断为761bp;MMP-9引物设计参照文献[3],上游为5,-AGGCCTCTACAGAGTCTTTG-3,,下游为5,-CAGTCCAACAAGAAAGGACG-3,,扩增片断为894bp;内参β-actin引物设计参照文献[3],上游为5,-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3,,下游5,-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC –3,,扩增片断为539bp。五. RT-PCR法检测1. Trizol一步法抽提总RNA:取冰冻角膜一只放入匀浆器匀浆,加入Trizol试剂0.8ml,匀浆,加氯仿200μl,震荡后离心,取上清,加入等体积异丙醇混匀,离心,弃上清,加75%酒精1 ml,离心后弃上清,空气中风干,加入无核酶水,58℃孵育10分钟,得到的RNA溶于焦炭酸二乙酯(diethylenepyrocarbonate DEPC)中,紫外分光光度计检测RNA纯度。2. 逆转录(25μl反应体系):取2μg RNA加入1μg oligodT及ddH2O共12μl 70℃反应5分钟,冰浴5分钟。加入M-MLV5×Buffer5μl ,dNTP 5μl,200U/μl M-MLV逆转录酶1μl,40U/μl Rnsin 0.7μl及ddH2O至25μl,42℃孵育90分钟。3. PCR(25μl反应体系):取cDNA 1μl加入引物上下游各25pmol,2.5mMdNTP2.0μl ,25mM Mgcl2 1.5μl, PCR Buffer(10Mm His-HCL PH8.3 50Mmkcl)2.5μl, Taq 多聚酶0.5μl 。扩增条件分别为:β-actin 变性94℃ 30sec,复性56℃ 30sec,延伸72℃ 45sec,共33个循环。MMP-2,MMP-9 变性94℃ 30sec,复性53℃ 45sec,延伸72℃ 1min,共35个循环。取10μl扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳,溴化乙锭染色,紫外光下观察,并用计算机凝胶成像系统提取图像,通过比较MMP-2, MMP-9与β-actin的密度值进行半定量分析。六. :实验仪器1)PCR仪(SLAN全自动荧光定量PCR仪,型号(SLAN) 中国HONGSHI公司,公司全称?)2)离心机 Thermo公司 ,型号labofuge400R3)水浴箱 天力医疗器械有限公司 型号:TL-420D型4)紫外透射仪 北京六一仪器厂 型号:WD-9403C5)数码相机 CAMON6) 琼脂糖凝胶电泳设备 北京六一仪器厂 型号:DYY-6C型7)引物设计应用Primer 5软件8)PCR仪中应用AlphaEaseFC软件分析六 小结FAK作为一种在组织中广泛分布的激酶,通过多种复杂的信号通路调控发挥生物学功能。FAK与细胞的迁移密切相关【21 J。影响内皮细胞FAK激活及内皮细胞迁移的刺激因素众多,整合素等细胞外成份可通过FAK等诱导细胞骨架等的变化并由此调节细胞的迁移及细胞周期等细胞生物学行为。对该通路的深入研究有 助于深入了解角膜溃疡等疾病的分子机制,并为临床治疗角膜炎提供新途径。随着对角膜炎分子机制的深入认识,必将发现一些新的整合素信号转导通路。然而这些刺激因素怎样激活FAK,如何参与FAK上下游的信号分子及FAK的磷酸化调节到底对粘着斑及细胞的迁移有怎样的最终影响,如何利用FAK作为靶点促进或抑制细胞的迁移,这些问题的解决还需要做许多工作。针对FA K 的更加深入的研究 ,将为阐明细胞内信号途径和多种疾病的治疗提供有力的帮助。
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