羽毛粉麸皮混合固态发酵条件优化

摘要：为了优化羽毛粉麸皮混合固态发酵条件，在发酵结束后测定固态发酵产率和发酵产物体外消化率，计算可消化物产率，并以此作为衡量指标对发酵条件（羽毛粉比例、缓冲液添加量、缓冲液pH、接种量、NJQ2接种比例、培养基厚度、发酵温度、发酵时间）进行优化。首先采用单因素试验对8个发酵条件进行初步优化，筛选出3个对发酵影响最大的因素，并确定其余5个因素的最优水平，筛选出的3个因素采用完全试验进一步优化。结果表明，最优发酵条件为羽毛粉比例50%，缓冲液添加量100%，缓冲液pH 7.5，接种量10%，NJQ2接种比例60%，培养基厚度1.5 cm，发酵温度37 ℃，发酵时间7 d。此时的发酵产率为86.2%，体外消化率为60.3%，可消化物产率为52.0%。通过发酵条件的优化，提高了发酵产物的体外消化率，理论上拓宽了羽毛粉的应用范围，具有很大的潜在经济价值。
　　　高压水解羽毛粉是由家禽羽毛经高温蒸煮、烘干、粉碎得到的一种新型蛋白质饲料[1]。其主要成分是角蛋白，粗蛋白含量为80%-85%，是目前已知的饲料原料中最高的。但是角蛋白结构非常致密[8]，不易溶于水，很难被胃蛋白酶和胰蛋白酶降解，因此未处理的羽毛消化率很低。经过高温蒸煮制成的高压水解羽毛粉，虽然角蛋白结构变得相对松散，其消化率与大豆、豆粕等优质蛋白质饲料仍有很大差距，这严重限制了它在畜禽配合饲料中的应用。目前，高压水解羽毛粉在配合饲料中的最大使用量为5%[2]，超量使用会导致动物营养不良，生长发育受阻。
　　　本实验室在家禽屠宰场筛选到两株角蛋白降解菌NJQ2、NJQ3，经鉴定均属芽孢杆菌[9]，均可分泌角蛋白酶[10]。经过实验室研究，角蛋白降解菌NJQ2、NJQ3对高压水解羽毛粉具有较强的降解作用，可以显著提高其消化率[3]。因此本实验室准备利用角蛋白降解菌NJQ2、NJQ3对高压水解羽毛粉进行发酵，并将发酵产物开发成一种新型蛋白质饲料。考虑到羽毛粉的营养特点，开发新型蛋白质饲料的目的以及技术本身的适用性，决定采用羽毛粉麸皮混合固态发酵。
　　　本文对羽毛粉麸皮混合固态发酵条件进行了优化研究，为羽毛粉麸皮混合固态发酵开发新型蛋白质饲料提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 高压水解羽毛粉及麸皮
　　　高压水解羽毛粉：采购于山东潍坊亚太中慧某养鸡场，为鸡羽毛经过高温蒸煮、烘干、粉碎所得，于阴凉干燥处储存。
　　　麸皮：采购于市场，于阴凉干燥处储存。
1.1.2 菌种
　　　由南京农业大学动物医学院临床应用分子生物学研究室筛选的角蛋白降解菌NJQ2、NJQ3。
1.2 方法
1.2.1 培养基及溶液配制
　　　种子培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 L，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min[4]。
　　　斜面培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L，pH 7.0，分装试管，121 ℃灭菌20 min[4]，凝固前倾斜放置。
　　　发酵培养基：羽毛粉、麸皮按比例混合均匀，然后按比例添加缓冲液，搅拌均匀后121 ℃灭菌20 min。
　　　缓冲液配方：氯化钠9 g/L，二水合磷酸二氢钠0.50 g/L，十二水合磷酸氢二钠6.01 g/L，无水硫酸镁0.15 g/L，pH 7.5。
1.2.2 种子液制备
　　　从斜面培养基上挑取一环NJQ2，接种于5 mL种子培养基中，37 ℃、120 r/min培养24 h，然后取菌液500 μL转接至50 mL种子培养基中，37 ℃、120 r/min培养18 h。NJQ3的培养与NJQ2相同。
1.2.3 接种与发酵
　　　将制备好的NJQ2与NJQ3种子液按照一定比例混合均匀后接种到发酵培养基中，接种后的发酵培养基放入恒温恒湿培养箱中培养。
1.2.4 发酵产率的测定
　　　发酵产物65℃烘干至恒重，用产物干重除以初始干重。
P = m1/m2×100%
P：发酵产率；m1：发酵产物干重；m2：初始干重
1.2.5 体外消化率的测定
　　　样品处理：65℃烘干至恒重的发酵产物，用研钵研磨成粉末，过40目筛。
　　　体外模拟消化：采用Boisen和Fernandez等的体外模拟消化方法，稍加改动，经胃蛋白酶-胰酶两步处理，来模拟单胃动物的消化过程[3]。原理是，首先在酸性条件下用胃蛋白酶模拟饲料在胃内的消化过程，再在碱性条件下用胰酶继续消化，模拟养分在小肠内的消化过程，最后将已消化与未消化养分分离开来，测定消化率。
　　　胃消化期：准确称取样品1.00 g，放在50 mL离心管中；加入10 mL生理盐水，缓慢搅拌；加入5 mL 0.2 mol/L的盐酸，用1 mol/L的盐酸或氢氧化钠将pH调至1.8；加入1 mL胃蛋白酶溶液（3 mg/mL）；加入0.1 mL氯霉素乙醇溶液(7.5 mg/mL)以防止微生物生长；将离心管置于摇床中，39 ℃，120 r/min振荡消化4 h。
　　　小肠消化期：加入5 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH 8.0)；加入1 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，用1 mol/L的盐酸或氢氧化钠将pH调至7.5；加入1 mL胰酶溶液（10 mg/mL）；将离心管置于摇床中，39 ℃，120 r/min振荡消化20 h。
　　　消化产物的处理：加入5 mL 20%的磺基水杨酸，混匀后室温下沉淀30 min，将溶解于水而未被消化的蛋白质沉淀出来；离心管放入高速冷冻离心机中，3000 r/min离心3 min，使残渣沉淀；弃上清后用1%的磺基水杨酸洗涤沉淀，3000 r/min离心3 min；弃上清后将离心管放入65 ℃烘箱中烘干至恒重；称量烘干后的残渣重量，计算体外消化率。
D = 1-m1/1.00×100%
D：体外消化率；m1：残渣重量
1.2.7 发酵优化试验方案
　　　首先对羽毛粉比例、缓冲液添加量、缓冲液pH、接种量、NJQ2接种比例、培养基厚度、发酵温度、发酵时间采用单因素试验[5]进行优化，以可消化物产率作为衡量标准。每个因素取5个水平，羽毛粉比例取40%、50%、60%、70%、80%；缓冲液添加量取50%、100%、150%、200%、250%；缓冲液pH取6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；接种量取2%、5%、10%、15%、20%；NJQ2接种比例取40%、50%、60%、70%、80%；培养基厚度取1 cm、1.5 cm、2.0 cm、2.5 cm、3.0 cm；发酵温度取33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃；发酵时间取1 d、3 d、5 d、7 d、9 d。
　　　单因素试验只能分析单个因素的影响，为了研究因素间可能存在的交互作用，还需要进行完全试验。根据单因子试验的结果，结合实际情况，在上述8个因素中选取3个对发酵影响最大的因素，进行三因素三水平的完全试验[5]，同样以可消化物产率作为衡量标准，以进一步优化发酵过程。选中的3个因素，各自选取最优的3个水平，这样完全试验总共有3×3×3 = 27个处理，每个处理设置3个重复。